Интеллектуальные беседы на тему биологии, нейробиологии, генетики
Ответить
Профессор
Участник
Баланс:1345
 
Сообщения: 87
Регистрация: 26.10.2019

О технологии CRISPR

Профессор » 05.08.2020 10:39

+
5
-
*CRISPR — точнее, CRISPR/Cas9 — инструмент редактирования геномов, основанный на элементе защитной системы бактерий, который был приспособлен для внесения изменений в ДНК животных и людей. Технология позволяет внести поправки уже не за несколько месяцев, а всего за пару дней.
Грубо говоря, теперь если нужно чтобы в стаде рождались одни только быки, а не коровы, то будут рождаться только быки.

Учёные из Калифорнийского университета в Дейвисе на протяжении нескольких лет редактировали ген эмбрионов крупного рогатого скота, определяющий пол. В апреле 2020 года появился бычок Космо (Cosmo) — и его ДНК демонстрирует перспективы данной области исследований.

Изображение

Телёнок запоздал. Его ждали 30 марта, но не дождались. Поначалу зоогенетик Элисон ван Эненнам объясняла задержку спецификой бычков: они норовят родиться на день-два позже нормального срока. Шли дни, и ван Эненнам нашла другое объяснение: эмбрионы с отредактированными генами — вроде того, который девять месяцев назад начал своё развитие в утробе Коровы 3113, — могут несколько запаздывать с подачей сигнала суррогатным матерям о своей готовности к родам.

Телёнок всё же родился: весом 110 фунтов, вороной — за исключением белых пятен над его задними копытцами. Двум ветеринарам пришлось цепями вытягивать его из Коровы 3113, но, когда его положили на подстилку из соломы, он был жив и здоров.

Всего двумя годами ранее в генной инженерии появилась перспективная технология CRISPR. Она открыла возможность внедрять в животноводство дизайнерские новшества, не прибегая к переносу генов животных одного вида другому. В основе старых генно-инженерных технологий лежит перемещение ДНК с помощью вирусов и бактерий, которое запускает дорогостоящий и длительный процесс одобрения со стороны регуляторных органов США. В результате, американские фермеры и владельцы ранчо, чтобы улучшить гены своих стад и отар, привыкли полагаться лишь на медленный и трудоёмкий прогресс селекционного разведения. Технология CRISPR обещала совершить революцию.

Ван Эненнам вознамерилась улучшить крупный рогатый скот, используя ген SRY — длинный участок Y-хромосомы, который диктует эмбрионам млекопитающих развитие мужских черт. В естественных условиях рождение у коров потомства разного пола — мужского (XY) или женского (XX) — равновероятно (это справедливо и для людей). Ван Эненнам надеялась получить возможность создавать стада, состоящие из одних самцов, добавляя с помощью CRISPR ген SRY в Х-хромосому эмбрионов крупного рогатого скота. Любые животные с геном SRY, даже генетические самки (с двумя X-хромосомами), физиологически были бы самцами.

Мясной промышленности нужен крупный рогатый скот помассивнее и помясистее, поэтому чем больше самцов — тем лучше, тем больше прибыль. Поскольку быки набирают вес лучше, чем коровы, выращивание одних быков позволит фермерам, имея меньшее поголовье скота, производить такое же количество мяса, как и прежде, и при этом уменьшить животноводческие выбросы в атмосферу парниковых газов.

На первом этапе исследователи попытались, используя CRISPR, внести нужные им изменения в эмбрионы крупного рогатого скота. По сути, технология CRISPR — это программируемый молекулярный скальпель. Нацелившись на определённый участок генома, он разрезает основную цепь двойной спирали ДНК. Затем вступает в дело клеточная система репарации, задача которой сшить разрезанную ДНК. Когда хотят добавить в место разреза новые фрагменты генетического кода, хитрость состоит в том, чтобы подсунуть клетке вместе с компонентами CRISPR нужный «образец для починки ДНК» — в данном случае копию гена SRY.

Эта технология лучше всего работает в клетках, которые активно делятся. А вот в одноклеточных эмбрионах использовать её тяжело.

Исследователям пришлось прибегнуть к более старому и менее предпочтительному методу: редактировать клетки быка и затем клонировать их ДНК в яйцеклетки. (Примерно в то же время китайская исследовательская группа успешно использовала эту технологию для того, чтобы с помощью CRISPR снабдить крупный рогатый скот геном устойчивости к туберкулёзу). Стремясь облегчить данный процесс, ученые добавили к гену SRY ген GFP (зелёного флуоресцентного белка). Эта добавка дала возможность видеть клетки с успешно вставленной в Х-хромосому генетической программой мужского развития. И вскоре заметили странное: все светящиеся клетки, то есть клетки с успешно отредактированной ДНК, перестали делиться. Проведённая редакция остановила их развитие.

В самом начале исследователи нацелились на участок Х-хромосомы, который, как они думали, находился в зоне «мусорной ДНК», вдали от всех жизненно важных генов. Но единственной картой генома крупного рогатого скота, которой они в то время располагали, был грубый портрет, созданный более десяти лет ранее. Когда весной 2018 года вышел в свет обновлённый геном крупного рогатого скота, выяснилось, что в ходе эксперимента ген SRY был вставлен не туда, куда следовало: расстояние от этого гена до гена, необходимого для роста клеток, оказалось вдвое меньше, чем 10 000 пар оснований.

Исследователи вернулись к исходному пункту и, чтобы никакие жизненно важные гены не влияли на редактирование, перепроектировали свою систему CRISPR, используя обновлённую карту. Затем они заново провели эксперимент с эмбрионами. На этот раз получилось удачно. Однако это случилось летом 2018 года, то есть прошло почти три года. Реализация проекта выбилась из графика. Исследователям пришлось попросить МСХ США продлить действие их гранта. Из-за долгой череды неудач Оуэн пребывал в крайне подавленном состоянии и жалел, что взялся за CRISPR-эксперименты с крупным рогатым скотом. Его успех с редактированием генома эмбрионов в новом месте Х-хромосомы приободрил его, но ненадолго. Эмбрионы первой партии, отредактированные и помещённые в матку тёлок, призванных сыграть роль суррогатных матерей, зачахли. Пять имплантированных эмбрионов из следующей партии вышли на уровень ранней стадии беременности, но через несколько недель и они пропали.

Вмешались ветеринары, которые предположили свою версию - исследователи повредили эмбрионы — возможно, во время биопсии, когда от эмбриона отделяют крохотный кусочек, чтобы провести секвенирование и определить, насколько удачным оказалось редактирование. Всё это требует времени, и, кроме того, пока лаборатория секвенирования не получит результаты, эмбрионы должны пребывать в замороженном виде. Каждый шаг — замораживание, биопсия, редактирование — снижает жизнеспособность эмбрионов.

Можно было действовать и проще: снова добавить ген, вызывающий флуоресцентное свечение, а потом осветить эмбрионы вспышкой ультрафиолетового излучения. Зелёное свечение сообщило бы о том, что редактирование прошло удачно, а значит, биопсия или заморозка не требуются. Но, поскольку GFP получают с помощью гена одного из видов биолюминесцентных медуз (тех, что обитают в прибрежных водах штата Вашингтон), создаваемые исследователями животные оказались бы генетически модифицированными организмами, или ГМО, а в этом случае заручиться поддержкой МСХ было бы очень трудно. Весь смысл проекта и использования CRISPR состоял в том, чтобы избежать создания ГМО.

Однако, пока исследователи пытались как-то преодолеть возникшее затруднение, нормативно-правовая база изменилась. В январе 2017 года FDA решило рассматривать любую отредактированную ДНК животных как новое лечебное средство. Для любого CRISPR-стада, состоящего исключительно из самцов, это означало, что к нему будут применять те же правила, какие установлены для ГМО первого поколения. И если, решила команда, редактировать ДНК коровы — это, как считают министерские чиновники, всё равно, что добавлять ген медузы, почему бы не облегчить себе задачу? Чтобы не связываться с этими чиновниками, животноводы или коммерческие организации скорее всего предпочтут игнорировать эксперименты с геном SRY, а раз так, то можно, не стесняясь, продолжить работу с геном GFP.

В последний раз ван Эненнам и Оуэн попытались вставить ген SRY вместе с геном GFP в геномы двухсот эмбрионов. Поскольку это была последняя попытка, исследователи решили вносить поправку не в Х-хромосому, как ранее, а в 17-ю хромосому — в её сайт, известный как «тихая гавань». В ходе этого эксперимента, говорит Оуэн, выжило двадцать два эмбриона, девять из них мерцали в ультрафиолетовом свете, но только один был целиком ярко-зелёным. И через месяц после переноса всех эмбрионов в матки тёлок только ярко-зелёный стал расти. Исследовательская группа решила назвать этого растущего телёнка Космо.

Чтобы узнать, приобрёл ли Космо мужские достоинства благодаря CRISPR, нужно было взглянуть на его ДНК. Из шеи телёнка взяли на анализ кровь. Едва кровь оказалась в пробирках, Оуэн побежал с ними в лабораторию, где поместил их в холодильник для 16-часового охлаждения. Придя домой, он выпил несколько бутылок пива, чтобы унять охватившее его нетерпение, и поставил будильник на 6:30 следующего утра. Оуэн проснулся в 5 часов и, хотя было ещё темно, поспешил в лабораторию. Проведя экстракцию ДНК из крови телёнка, он применил гель-электрофорез продуктов ПЦР, чтобы выявить присутствие добавленных генов SRY и GFP.

Полного триумфа не получилось. Как установили исследователи, Космо имел пару хромосом XY, то есть был бы самцом даже без редактирования его генома, ибо унаследовал ген SRY от своего биологического отца. Однако благодаря вставке, произведённой Оуэном, этот ген оказался и в его 17-й хромосоме, а значит, эксперимент удался: впервые в мире технология CRISPR успешно сработала в эмбрионе крупного рогатого скота.

https://www.wired.com/story/a-crispr-ca ... ely-a-boy/
https://22century.ru/popular-science-pu ... ispr-cosmo
Поделиться:

Ответить    ПОМОЩЬ по форуму!